流式细胞术检测与免疫荧光反应

免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理。美国就医机构爱诺美康了解到，通过化学反应使标记抗的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术。

免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高，定位准确，形态与功能相结合等特点。

美国就医机构爱诺美康了解到，免疫组化常见问题分析：

1.显色过深：一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低一抗浓度或建少孵育时间；孵育温度过高，建议室温4度；HRP标记二抗孵育时间过长，建议减少时间

2.非特异性显色：石蜡切片脱腊不彻底，建议延长脱腊时间。

操作过程中冲洗不冲充分，建议增加冲洗的次数与冲洗的时间。

发生抗原异味。

蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。

3.显色强度弱：一抗浓度过低或孵育时间过短；操作过程中冲洗过度，建议适度冲洗。

  免疫荧光又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位
 该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。

免疫荧光常见问题分析：

1.背景过高：一抗或二抗浓度太高；封闭不完全，建议增加蛋白封闭时间；可通过调节荧光显微镜的参数降低背景；

2.信号弱无信号：无目的蛋白或表达量极少；细胞通透性差；一抗二抗浓度太低。

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。

美国就医机构爱诺美康介绍，流式特点：1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（ FCM综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。

取CEM野生型细胞用PBS洗涤两次，然后在lml冷（-20℃)甲醇和乙醇(50/50)的混合物中固定过夜，2000r/min离心5分钟后，将细胞混于PBT溶液中，浓度调至每毫升约lx106个细胞，并在20^下孵育10分钟。将细胞离心，然后与PBT中的小鼠单克隆抗TK1抗体（克隆1D11，1E3,lmg/ml,1:50稀释）孵育30分钟，然后用PBS洗涤并与FITC标记的小鼠单克隆IgG抗体（Sigma，Sweden)在暗室中培育30分钟。用PBS洗涤两次后，将细胞重新悬浮于lml由PBS、30fig/ml核糖核酸酶A(Sigma)、0.1%V/VTritonX-100和20)ug/ml丙酰碘（PI)组成的染色溶液中。将细胞在20℃下于染色缓冲液中孵育30分钟，随后在流式细胞仪（Becton Dickinson FACscalibur,Becton Dickinson,San Jose,CA，USA)中分析，使用15mW的空气冷却氩离子激光器激发的488nm的激光。通过用于FITC的530/30带通滤波器和用于PI的582/42带通滤波器收集荧光发射。以线性标度收集FITC和PI荧光数据，每个样本至少收集了50000细胞。采用CellQuest软件（Becton Dickison)用于获取数据，分析和呈现图谱。