分子诊断的检测过程，常规质量的评估

单个分子检测的工作流程是从临床分子诊断实验室收到并登记样品开始的。美国治病机构爱诺美康了解到，随后是提取核酸（DNA或RNA)、测试设置、分析物的检测（如PCR产物）、数据分析的提取，然后是将结果报告到患者的医疗记录卡上抽提完整的、高质量的DNA是分子检测的基础。DNA和RNA提取程序的各个阶段有指定的专用区域、设备和材料。DNA和RNA分离可通过手动或自动方式进行。

对于DNA提取，样本的保存时间，如血液、骨髓和液体样品更好不要超过5天；冷冻的或固定的组织，时间不受限制；新鲜组织是更好不过夜。虽然使用固定和包埋的组织标本进行分析没有时间限制，但是时间较长的样本可能会影响DNA的质和量。因为RNA相对DNA更加不稳定，血液和骨髓中的时间更好是少于48小时（从收集的时间）。用于RNA分析的组织样品，应在新鲜的状态下及时处理，快速冷冻，或保病理学家判断样品质量存在RNA稳定试剂中运输。

图 临床分子检测流程简图

目前，大多数临床实验室使用的是基于液体或固相萃取的商品化的产品步骤。有核细胞会先于核酸从生物样本中被提取出。血液和骨髓样品中的WBC可用不同的方法进行分离。

美国治病机构爱诺美康了解到，一种方法是用氯化铵溶液使红细胞溶解，获得完整的WBC和其他有核细胞。另一种方法是使用聚蔗糖溶液（Ficoll)梯度制备方法，这一方法只产生单核细胞群。

FFPE组织块切片在DNA提取前，首先去除石蜡并用蛋白酶K消化进行破膜。新鲜和冷冻的组织在核酸抽提前也要先进行蛋白酶K消化处理。DNA抽提包括以下步骤：细胞裂解，通过盐析蛋白质和其他碎片（无机法）的DNA纯化，或通过用苯酚和氯仿溶液（有机方法）萃取蛋白质。

随后，将DNA从异丙醇或乙醇的溶液中沉淀出来。DNA沉淀用70%〜80%的乙醇清洗，然后用缓冲液，如Tris-EDTA溶解。蛋白酶K的添加可帮助裂解并防止DNA的非特异性降解。有时添加核糖核酸酶（RNase)去除RNA的污染。

DNA产量通过定量的分光光度计测定。如果有必要，可用琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色目测鉴定DNA样品的完整性。完整DNA显示为高分子量单一条带，而降解的DNA则显示为大小不一的碎片。PCR分析之前，萃取的DNA储存于4°C，并随后在测试结束后保存于-70T：。因为从甲醛溶液固定的组织中提取的DNA会不同程度降解，通过凝胶电泳对提取产物的分析并不能提供太多信息。DNA的产量和完整性更好通过扩增对照来评估，以确保DNA的质量和数量足够获得可靠的结果。

RNA分离步骤与前面描述的DNA提取步骤类似。但是，由于其单链构象和对普遍存在于环境中的RNA酶降解的易感性，RNA相对DNA是不稳定的。

为确保目标RNA的完善保存，就需要一些特别的预防措施，包括在RNA的抽提过程中使用的所有试剂都使用焦碳酸二乙酯（DEPC)水处理，以及工作区和移液器特殊去污处理防止RNase污染。

提取的RNA通常有不同程度的降解，所以通过凝胶电泳对提取产物的分析不能提供完整信息。RNA的质量及评估RNA是否适用于以反转录聚合酶链反应（RT-PCR)为基础的检测，更适合的方法是通过一个管家基因，如ABL1和GAPDH的RNA转录检测实验的阳性结果来评估。任一RNA若260/280的吸收比值低于1.9或高于2.0则可能包含污染，在分析之前需进行净化处理。

美国治病机构爱诺美康介绍，核酸提取之后，实验是由合格的实验室工作人员根据确认/验证试验过程中已确定成文的程序建立起来的。实验的各个阶段（如提取、基于扩增试验的PCR前后）都指定了专用区域、设备和材料。

作为常规质量的评估，对于每一个分子肿瘤学试验，每个测试反应都包含阳性和阴性对照标本。一个含有除了核酸以外完整反应混合物的没有模板（空白）的对照，也要包含在基于扩增的测试反应体系中，来评估在实验试剂中是否有扩增子污染而导致的不准确结果。

这些对照用与患者样本相同的处理方法，以确保建立的实验体系符合用于测试反应的各个步骤（提取、扩增和检测）。所有试验的对照和运行的整体性能必须在结果解读之前进行检查。验收对照之后，结果以电子报告形式输入。更终报告由实验室主任或由CLIA确认的与主任同样资格的特定人员（见前面）审查和签字。