ALK融合基因检测方法学​

ALK融合基因检测可在DNA、RNA及蛋白3个层面进行，检测方法更加多样。出国医疗机构爱诺美康了解到，针对我国现状，2013版《中国间变性淋巴瘤激酶C4ZJ0阳性非小细胞肺癌诊断专家共识》推荐ALK-FISH、基于PCR扩增技术的RT-PCR以及VentanaIHC均可作为ALK阳性肺癌的诊断技术(图)。检测实验室可根据临床样本类型选择合适的检测技术，样本质量控制应由有经验的病理医师负责。当怀疑一种检测技术结果的可靠性时，可考虑采用另一种技术加以验证。

图 目前临床上常用的融合基因检测试剂盒

基于DNA层面的FISH法

1.适用的标本类型及探针设计，适合ALK-FISH检测的样本是10%中性福尔马林固定的石蜡包埋标本，防脱玻片切片厚度3~5μm。

ALK抑制剂克唑替尼治疗ALK阳性NSCLC的大型临床试验均是基于FISH的诊断结果，因此2011年美国FDA批准克唑替尼用于ALK阳性NSCLC治疗的同时，ALK-FISH分离探针试剂盒，也同时获批成为伴随诊断试剂盒。FISH检测是目前确定融合基因的标准参照方法。该诊断试剂盒设计的两种探针分别标记ALK基因第20号外显子断裂点的两端，橘红色信号代表3'端(大约300kb)，绿色信号代表5'端(大约442kb)。

2. 杂交标本质量评估，在进行FISH结果评估之前，首先需要评估杂交标本的质量，这点十分关键。需要严格评估组织形态学质量和杂交信号的强度来决定杂交样本是否适合进行结果分析。形态学结构好、杂交信号强度强且背景信号弱的标本适合结果分析。相反，如果标本存在染色质消化过度或探针穿透能力差时，必须找到原因改进后重新检测;如果出现技术性人工假象导致的含有成串信号的细胞核互相重叠而无法分离红绿信号之间的距离，这种标本也不适合进行结果分析。

评分细胞的选择：ALK基因重排在肿瘤内为均匀分布，因此不需要根据形态学或免疫表型选择特定的肿瘤区域进行细胞计数，在几个不同肿瘤区域进行细胞计数即可。只对形态完好没有相互重叠且至少含有一个5'和3'信号的肿瘤细胞进行计数。建议在计数细胞过程中用一张连续的HE染色切片作为参照，帮助识别肿瘤细胞。

3. 结果评估理论上，来自同一个基因组区域的5'和3'探针在分子水平上的位置十分靠近。正常细胞中这两个信号的表现为融合在一起、互相接触或距离很近(5'和3'信号之间的距离小于信号直径的两倍);在发生AKL基因断裂的肿瘤细胞中，ALK基因5'端的绿色信号远离3’端的橘红色信号（间隔多2个信号直径)，即为分离信号，细胞被判读为分离形态U/JC阳性)。如果出现单一的5'或3'信号，两者的信号数目不需要相等，可判读为信号分离。