EGFR基因突变检测方法

EGFR突变检测方法主要是基于PCR的方法，包括直接测序、扩增阻滞突变系统(ARMS-PCR)、Cobas-PCR、TaqManPCR等。出国医疗机构爱诺美康了解到，其他方法包括局效液相色谱法、飞行质谱法、二代测序等。每种方法各有优缺点，操作的复杂程度、步骤的多寡、检测的灵敏度等各方面均不相同（图)。

EGFR突变检测方法的比较

出国医疗机构爱诺美康了解到，临床检测可根据临床样本的特点、样本的大小选择合适的检测方法。《中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家共识》和《中国表皮生长因子受体基因突变和间变淋巴瘤激酶融合基因阳性非小细胞肺癌诊断治疗指南(2013版)》推荐DNA直接测序法和ARMS法检测EGFR基因突变。此两种方法也是目前临床上更为常用的方法。

(―)DNA测序

DNA直接测序法可检测已知和未知突变，过去被认为是基因突变检测的“金标准”。基本原理是双脱氧链末端终止法即Sanger测序法。采用PCR纯化产物为模板，加入引物，四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，同时加人限量的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，在DNA聚合酶的作用下进行反应。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3'-0H基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，形成一系列长度相差一个碱基的核酸片段。采用变性聚丙烯凝胶电泳或毛细管电泳对序列进行分析。DNA直接测序法检测流程相对复杂，耗时较长，由于实验过程涉及PCR产物的多次开管操作，检测过程特别需要注意防止交叉污染。另外，Sanger测序灵敏度相对较低(10%~25%)，当突变DNA比例较小时直接测序法不能检出突变，因此对于细胞学样本或血液样本不是更佳的检测方法。

(二）ARMS-PCR

ARMS-PCR法是检测已知突变的一种方法，其基本原理是利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测，以达到对基因突变检测的高特异性和高灵敏度。ARMS方法检测灵敏度明显高于直接测序法，可检测出样品中含量低至的突变基因;该方法在设计上更大限度地缩短了目标产物的长度，可以解决石蜡包埋组织标本提取的DNA大部分片段化而无法得到准确检测结果的难点;该方法结合实时PCR平台实现扩增时闭管操作，操作简单，无需产物的后处理，能更大程度地避免扩增产物的污染。检测耗时短，上机后90分钟即可出结果，易于在临床开展，目前是临床上进行突变检测更常用的方法。

我国目前已经有越来越多的医院开展价EGFR基因突变检测，全国的检测率也在逐年上升。与2011年相比，我国基因突变检测中心数已由39家上升至110家，检测率由2011年的6%上升至2014年的27%突变率在30%左右，平均检测时间为6天。与欧美及日本比较，我国ECFR基因突变的检测率仍偏低(图2)，但检测质量在逐年提高。国家卫生和计划生育委员会病理质控评价中心（PQCC)自2012年起开展EGFR基因突变检测室间质评，通过率逐年提升，到2014年室间质评通过率达到了91%(图3)。

图2 不同国家和ALK基因突变检测率比较

图3 2012—2014年度沉抑突变检测PQCC室间质评