使用Sanger测序外显子组突变分析

使用Sanger测序外显子组突变分析研究显示，通过基因家族的方法鉴定癌基因已被证明非常有效，但这仍是一种候选鉴定的方法，因此不可避免存在偏倚。美国看病机构爱诺美康了解到，癌症基因突变谱的下一步分析是对外显子组测序，外显子组指整个人类基因组（18000个蛋白质编码基因）的编码区。

目前，使用Sanger测序已完成包括乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢透明细胞癌、多形性胶质母细胞瘤及髓母细胞瘤在内的许多不同肿瘤的外显子组分析。

这些大规模的分析首次使研究人员能够描述和理解人类癌症遗传的复杂性。美国看病机构爱诺美康了解到，这些外显子组研究的目标是，提供在人类肿瘤中进行全外显子组突变分析的方法，明确其体细胞突变谱和数量，并更终发现肿瘤发生过程中的新基因，以及肿瘤中发挥作用的新的信号通路。在这些研究中，序列数据与基因表达和拷贝数分析相互补充，从而首次展现了人类肿瘤遗传复杂性的全貌4548。从这些分析中我们可以得出以下结论。

1.每个肿瘤的基因组在编码区平均存在30〜100个体细胞变异，这比以前预想得要高。尽管这些变异包括点突变、小的插人和缺失或扩增，但是观察到的绝大部分突变多为单碱基的替换。

2.即使是在单一类型的癌症中也存在明显的肿瘤内的异质性。即肿瘤中存在多种突变模式（包含不同的突变基因），这些肿瘤用组织学分析无法进行区分。每一个肿瘤都有独特的遗传背景，这个观点与个体化医疗密切相关，下面将对此观点进行探讨。

3.不同肿瘤类型的突变谱及突变的核苷酸都有差别。例如，结肠癌中50%的突变为C:G到T:A的转换，10%为C:G到G:C的颠换。相比之下，乳腺癌中只有35%的突变为C:G到T:A的转换，而29%为C:G到G:C的颠换。了解突变谱对深入剖析研究不同肿瘤的突变发生及其修复机制至关重要。

4.发现了大量以前从未报道与癌症有关的基因在癌变过程中发挥作用。

5.儿童的实体瘤，如髓母细胞瘤，发生变异的基因数平均只有典型成人实体瘤的1/10〜1/5。与成人实体瘤相比，这些儿童肿瘤同样较少在编码基因中出现扩增和纯合性丢失重要的是，为了处理这些基因组项目产生的大量数据，急需开发新的统计学和生物信息学工具。再者，检测所有已鉴定突变的分布有可能重新认识癌症的基因组特征，并重新定义癌症基因。这些有关癌症遗传学的新观点将在后面章节进一步探讨。从这些研究中得出的结论大大地改变了对癌症遗传学的理解。

在12%被分析的肿瘤中发现IDH1基因活性位点高频突变，明确地证实了全外显子组分析的无偏倚特性的作用，以前未发现该基因与胶质瘤有关。由于恶性胶质瘤是中枢神经系统更常见的致死性肿瘤，多形性胶质母细胞瘤（glioblastomamultiforme，GBM;世界卫生组织定义为IV级星形细胞瘤）是生物学行为中侵袭性更强的亚型，新的GBM基因IDH1的发现具有极其重要的意义。重要的是，IDH1突变主要发生在年轻患者，并与较好的预后相关。随后的研究表明，IDH1突变发生在胶质瘤演进早期，R132体细胞突变在大部分（超过70%)n级和m级星形胶质细胞瘤和少突胶质细胞瘤中存在，也存在于由这些低级病变发展而来的继发性GBM中。相反，这些变异仅在不超过10%的原发性GBM中存在。

另外，对相关IDH2基因的分析发现R172位氨基酸残基常存在体细胞突变，该位点与IDH1基因中高频突变的R132氨基酸残基位点非常类似。美国看病机构爱诺美康介绍，这些突变通常与IDH1的突变以互斥的形式发生，提示它们对表型的影响作用相当。随后，IDH1基因的突变在其他类型的癌症中被报道，包括血液系统的肿瘤。