基因鉴定新一代测序技术的应用

1977年，使用链终止抑制剂进行DNA测序的Sanger法的引进，对生物医学研究产生了变革性的影响。海外医疗机构爱诺美康了解到，在过去30年中，测序技术已经被广泛地用于DNA分子的核苷酸序列分析。然而，随着对癌症样本进行全基因组测序等大规模测序计划的启动，需要研发新的技术，这就是众所周知的新一代测序技术。新一代测序技术大大地降低了人类基因组上3×10⁹个碱基对测序所需要的成本和时间。并且，特别是对癌症基因组分析时，与Sanger测序相比新一代测序技术具有一系列优势。

首先，新一代测序技术比Sanger测序更加敏感，它甚至可以检测到仅存在于部分肿瘤细胞中的体细胞突变。此外，这一新的测序策略是定量的，可用于同时测定核苷酸序列和拷贝数变异。它们也可以与其他方法配合，如参与双端测序可读序列的方法，可用于识别癌症基因组中多种常见结构的变异，如插入、缺失和重排。

海外医疗机构爱诺美康了解到，新一代测序技术仍然存在一定的局限性，主要因为测序过程中短的可读序列出错率比较高。另外，这些短的可读序列使重新组装拼接序列，以及将这些读取序列匹配到参考基因组上的任务非常复杂。为了克服目前存在的这些缺陷，要求检测的基因组被深度覆盖，并且必须要对鉴定出的变异进行仔细验证，通常是使用Sanger测序法验证。结果是这将增加实验的费用和分析的时间。因此，新一代测序技术用于癌症样本的全基因组测序现在已是可行的，但还不能常规地开展。要想在临床实践中解码每一个癌症患者每一恶性肿瘤的全基因组，仍需要进一步的技术改进。

过去几年中新一代测序平台数量大幅增长，目前包括Roche/454、Illumina/Solexa、Life/APG’s SOLiD3、Helicos BioSciences/HeliScope及Pacific Biosciences/PacBio RS等技术。

值得注意的是，近期推出了包括Polonator G.007仪器平台（一个可以免费获取软件和协议的开放源代码平台）、离子激流半导体测序仪（Ion Torrent’ssemiconductor sequencer)及使用了自组装DNA纳米球或纳米孔技术的测序平台这些新仪器正在推动着第三代测序技术时代的到来，由于它们可以在降低成本的基础上大幅提高分析的速度和准确性，并增加人类基因组单分子测序的可能性，因此可以为临床带来巨大效益。

新一代测序技术平台的比较见下图。各种平台技术由于在模板准备、核苷酸测序和图像处理策略上存在不同，更终导致了它们性能上的差异。归根结底，更合适的方法取决于特定的基因组测序项目61。

图1 下一代测序平台的比较分析

目前的模板制备方法：

首先，将基因组DNA随机剪切成更小的片段，以构建片段化的模板（fragment templates)文库或者对应配对模板（mate-pair templates)文库；

然后，通过乳液聚合酶链反应（PCR)或者固相扩增，从单个DNA分子克隆扩增模板。或者，通过只需要较少的起始样本并且不涉及PCR扩增反应的方法来准备单分子模板也是有可能的，因为PCR反应可能是人工引人突变的来源。模板准备好后便被附着在空间分隔位点的固相表面上，这样的固相表面允许几千至几十亿个核苷酸测序反应同时进行。

目前，不同新一代测序平台使用不同的测序方法，测序方法可被分成四类：循环可逆终止法、单核苷酸增加法、实时测序法和连接测序法。这些测序策略配合不同的图像处理方法，包括基于生物发光信号测量的方法或涉及单分子事件四色成像的方法。更后，来自这些核苷酸测序平台的海量数据，利用与新一代测序技术同时发展起来的强大的生物信息学工具进行存储、组装和分析。

新一代测序技术标志着我们进人了一个新的解码癌症基因组的领域，并且已经被应用于癌症研究。海外医疗机构爱诺美康介绍，将该方法应用到癌症全基因组研究的是Ley等的研究小组，他们在2008年首次通过Illumina/Solexa平台对来自同一个患者的急性粒细胞性白血病（AML)组织和相应正常组织的完整基因组进行了测序。如同下文将进一步描述的那样，这项工作鉴定了AML中公认的致癌相关点突变和结构改变，并为下一代基因组测序技术在癌症研究中的应用提供了代表性的范例。