双侧视网膜母细胞瘤患者RB1基因生殖细胞突变

RB1基因生殖细胞突变使存活下来的双侧视网膜母细胞瘤患者对黑色素瘤易感。海外看病机构爱诺美康了解到，在这些患者的黑色素瘤组织中，存在残留的野生型RB1等位基因杂合性丢失，发生RB1基因LOH的个体在其有生之年患黑色素瘤的风险增加了4〜80倍。在一些原发性皮肤黑色素瘤中，RB1基因位点存在缺失,在极少数情况下存在RB1基因重排。

海外看病机构爱诺美康介绍，检测视网膜母细胞瘤(RB)病人体细胞中RB1基因突变，探讨RB1基因突变的分子生物学机制。方法 应用PCR-SSCP技术筛查RB病人白细胞基因组DNA，测序分析确定突变。

海外看病机构爱诺美康了解到，在12例RB病人中，确定3例RB1基因生殖细胞性突变。他们分别是第10外显子中T至A杂合性突变， 将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列;第10外显子1bp碱基缺失  (GAT→AT);第22外显子中 A至T杂合性突变， 将精氨酸序列变为终止密码。这3例RB1基因生殖细胞性突变的方式为点突变和小缺失，这些突变改变了RB1基因的遗传信息，致使异常的RB1基因蛋白产生，导致视网膜母细胞瘤的发生。

视网膜母细胞瘤(简称RB)，是婴幼儿至多见的高度恶性、致死率高的眼内恶性肿瘤。海外看病机构爱诺美康了解到，由视网膜母细胞瘤基因(RB1基因)的两条等位基因同时失活所致，分遗传型(30%～40%)和非遗传型(60%～70%)两种方式。

遗传型视网膜母细胞瘤病人体细胞都携带RB1基因生殖细胞性突变，85%～90%可能会发生双眼或单眼多灶型视网膜母细胞瘤，下一代子女中约有50%的机会遗传这一突变的基因，而其中的90%会患视网膜母细胞瘤。因而，基于RB1基因生殖细胞性突变检测(遗传分型、产前与症状前基因诊断)，目前是视网膜母细胞瘤的预防与早期诊断的有效途径。

为了进一步了解RB病人RB1基因的突变特点，为临床遗传检查提供更多可靠的信息，笔者应用分子生物学技术对RB病人体细胞中RB1基因进行突变位点的检测，并结合以前的工作，探讨了RB1基因突变的分子生物学机制。

RB1基因(视网膜母细胞瘤易患基因)位于人类13号染色体长臂1区4带，有27个外显子，分布范围180kb，转录一4.7kbmRNA，其蛋白产物为一115kb核内磷酸蛋白。各种原因致使RB1基因失活是视网膜母细胞瘤发生的直接原因。

海外看病机构爱诺美康介绍，RB分遗传性和非遗传性两种。遗传性和非遗传性病例发病特征的差别，可以用Knudson的二次突变学说解释。Knudson于1971年提出的二次突变学说认为RB发生要经历两次突变。遗传性第一次突变是生殖细胞突变，由此发育而来的子代所有体细胞均带有一次突变，表现肿瘤易感性。

视网膜任何一个细胞只需发生一次突变即可发生RB，而其他部位体细胞也只需一次突变即可发生恶性肿瘤，故RB发生早，多中心，发生第二肿瘤危险性高，且可遗传。这种生殖细胞突变可以来自病人父母的遗传(有家族史)，但以胚胎发育早期的生殖细胞新发生的突变更多见(无家族史)，非遗传型RB病人中，生殖细胞遗传了正常的两个RB基因，两次突变需发生于同一视网膜细胞才可能发病。因为同一细胞连续发生两次突变可能性非常小、故这些病例总是单侧单中心性发生，且发病晚。而所有体细胞遗传了正常的RB基因。所以发生二次恶性肿瘤的危险性与正常人相同。

国内临床上对视网膜母细胞瘤做出诊断时大多数患儿已近晚期，只好行眼球摘除术以保性命。应用分子生物学及分子遗传学方法检测RB1基因突变，结合基因连锁分析，可在分子水平上进行RB1的产前及产后早期诊断和遗传咨询。应用PCR—SSCP直接测序方法可以检测出病人体细胞内RB1基因的杂合突变，尤其是对那些得不到肿瘤标本的病例更为适用。SSCP技术具有较高的敏感性，可检测至序列中单一碱基的变化。内部结构有变化的单链DNA片段在电泳中发生迁移率的变化，使相应的DNA电泳带超前或滞后异于正常应有的位置。对于经SSCP 检测所发现有结构异常的标本，再对其进行序列分析。本研究中2例10号外显子电泳带显示超前的异常泳动带形，1例22号外显子电泳带显示滞后的异常泳动带形。经DNA测序均发现RB1基因突变。PCR-SSCP可检出标本DNA结构异常的存在。且处理标本量大、迅速，适用于目的基因结构异常的筛选，联合序列分析，则可至终证实基因改变的类型及确切存在的部位。

RB1基因突变发生的种类：以碱基变化为标准，可以将突变分为点突变(置换与颠换)、小缺失、小插入及复杂突变4类。申煌煊在分析21个RB1基因组成型突变中发现，中国人的RB1基因突变虽然也有4种不同的突变方式，但以微小突变为主。笔者采用PCR-SSCP-直接测序技术对12例RB病人RB1基因进行了研究，分析了血液白细胞中的RB1基因的启动子及27个外显子，发现3例RB1基因生殖细胞性突变，2例为双眼 RB病人，1例为单眼RB病人。笔者所确定的4例(本文3例，以前1例)RB病人和1例表现型正常的RB1基因突变携带者，其生殖细胞性突变方式为点突变和小缺失，均为微小突变。点突变往往改变了正常的遗传信息。本研究中标本3第10外显子5’端至3’端第22bp处发生 T至A突变，将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列;标本14第22号外显子第36bp处发生 A至T突变，将精氨酸序列变为终止密码，这就不可避免地影响了RB1基因编码的蛋白质的质量。RB1基因的缺失改变可因破坏阅读框架，产生终止密码而影响正常转录，标本7第10外显子第64bp处发生1bp碱基缺失，发生阅读框架改变。这些改变均导致RB1基因不能完成正常的转录过程而不能编码出正常的 RB蛋白，从而失去了对视网膜细胞的生长、分化的负反馈调节作用，使细胞生长处于无限制地生长状态，致使视网膜母细胞瘤的发生。

RB基因的检测和定性加深了笔者对人类肿瘤的理解，在肿瘤发病的分子机制及利用突变分析进行遗传咨询方面取得了很大进步。RB基因突变携带者的检测非常重要，因为它不仅引起RB，还可导致其他肿瘤。更好地认识RB1基因突变的不同类型，不仅对RB发病机制的认识有重大理论指导意义，而且可进行产前诊断和早期诊断及对家族性病例提供现实的指导服务。